关于如何在 PCR 过程中远离污染的简单提示

PCR技术是一种在体外模拟DNA复制过程的核酸扩增技术。它主要是重复三个循环：高温变性、低温退火和延伸，然后将目标DNA扩增数百万倍。 因此，PCR技术的优点是灵敏度极高。但每一枚硬币都有两个面，PCR技术最大的缺点是非常容易被污染，极少量的污染就会导致假阳性。

一旦发生实验室核酸污染，必须停止正常的实验。然后需要大量的物力和人力资源，直到找到污染源，或者实验室的清洁度达标。 此外，实验报告必须作废。结果只有在重新实验后才可靠。

为了有效避免污染，获得稳定可靠的检测结果，我们在实际工作中往往需要采取一定的措施来预防或消除污染。

污染源：

• 试剂污染

由于试剂容器、容器、水和其他溶液在制备 PCR 试剂的过程中会被核酸污染。

• 设备污染

半自动核酸提取器和全自动核酸提取器在提取过程中会导致样本或核酸模板溢出，污染机器。或者设备内的垃圾桶清洗不彻底，残留液体或结晶挥发形成气溶胶，进而产生污染。

• 标本交叉污染

造成标本交叉污染的原因有多种：标本采集容器被污染；标本放置时因密封不良而溢出容器；标本粘在容器外； 吸入器的污染和空气中的气溶胶。特别是，病毒可以通过气溶胶或通过形成气溶胶扩散，造成相互污染。

• PCR产物污染

这是 PCR 中最常见的污染问题。常见于扩增后需要打开或扩增后产物处理不当的检测。因为 PCR 产物的拷贝大小远远大于 PCR 检测的几个拷贝的最大值。 因此，极少量的 PCR 产物污染可以形成假阳性。

• 克隆质粒污染

阳性参考常用于实验室操作，而这些阳性参考大多来自某些克隆质粒。单位体积中克隆质粒的浓度很高，使用不慎极易被污染。

一些实验室自行克隆质粒作为质控品。但是，经过制备后，垃圾的处理方法不够严格，导致质控品对实验室的污染，进而对标本造成污染。

控制污染的措施

• 实验区划

合理分隔实验室。分区或分区操作以下步骤：标本处理、PCR反应液制备、PCR循环扩增、PCR产物鉴定等。 此外，应特别注意标本处理和PCR产物鉴定必须与其他步骤分开。

最好划分为：标本处理区、PCR反应液制备区、PCR循环扩增区、PCR产物鉴定区。并且他们的实验用品和吸气器应该专门使用。

实验室使用的紫外线应在实验前进行灭菌，以破坏残留的 DNA 或 RNA。

• 各区文章不得混用

各实验区应用醒目的颜色清楚地标明不同的设备和物品，避免不同工作区域的设备和物品混在一起。例如，各个区域专门使用的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、钢笔等。

使用一次性移液器吸头、离心管、无尘手套、口罩等。

• 建立标准的空调通风系统

尽可能使用全送全排空调系统空调系统。在进入各个操作区的过程中，需要严格的单一流向，即试剂制备和储存区→样品制备区→PCR扩增区→扩增产物分析区，不能逆行。

• 污染监测

采取以下措施进行污染监测：建立阳性对照和阴性对照、重复试验、选择不同区域的引物进行PCR扩增等，从而采取预防和消除污染的措施。

• 定期实验室清洁

准备含0.5%有效氯的消毒液擦拭设备表面、台面、地板、物品表面、通行箱、门窗，并浸泡设备内的垃圾桶。

酒精对空气喷涂是按照自上而下、由内而外的原理进行的。

用酒精 (75%) 擦拭移液器、八管离心机、混合摇床和其他小型设备。

用纯净水擦拭设备表面、台面和地板，并用纯净水冲洗设备废罐。