基本的细胞培养过程和程序

细胞培养过程和过程因细胞类型和应用而异。 我们需要意识到，如果不以适合每个过程的方式处理细胞，它们的特征可能会改变。 本节介绍了一般细胞培养过程和程序，同时指出了要考虑的重要点。

细胞培养细胞的制备

图：广义细胞培养过程的流程图

有两种用于获取细胞的方法：从细胞库或从供体组织中隔离细胞。 当从细胞库中获得的细胞开始培养时，需要经过“解冻”，“细胞播种”和“细胞观察”的程序。

当使用从供体收集的组织时，如果附着的话，通常会去除不必要的组织。 有两种主要方法可以将细胞与组织，外植体培养和酶促方法分离。 在酶促方法中，使用蛋白水解酶溶液从感兴趣的组织中分离细胞。 如果使用酶，请用酶反应抑制剂稀释酶或停止酶反应，然后继续进行“细胞播种”和“细胞观察”的步骤，以准备细胞培养。

解冻

解冻冷冻的冷冻保存细胞启动细胞培养，可能被认为是“唤醒细胞”。 从细胞库中获得的一瓶冷冻细胞从液体氮气罐*1或低温深冰箱（-150°C）转移到适当的冷藏容器，例如液态氮容器，转运到长凳上，并融化并融化 在37°C的水浴或熔化设备中*2。 在冰几乎融化之前，迅速添加培养基以稀释冷冻保护剂液体（例如DMSO），通过离心将细胞沉淀出来，并在去除上清液后，添加了预先加热到37°C的上清液后。 然后通过移液重悬于细胞，并使用显微镜或细胞计数器测量细胞/细胞浓度的数量。

*1：有两种方法可以在液氮罐中冷冻和保存细胞：使用液氮的冷气，“蒸气相”，“液相”，其中冷冻保存的物体直接浸入液氮中。 在液态相的情况下，可以将其保存在-196°C，即液氮的温度，但液氮进入冷冻的小瓶并用细菌，酵母，酵母，肉芽肿，分生孢子，，菌质，分枝菌，，有液氮的风险很高。 和其他小瓶的病毒。 因此，强烈建议在蒸气相中存储。

*2：如果将其储存在液相中的小瓶被放置在37°C的水浴中，或者将液氮保留在小瓶中的熔融设备中，则可能会破裂。 盖子应松开一次并重新固定，然后将其放在37°C的水浴中。

细胞播种

为了达到目标细胞播种密度，请根据测量的细胞数量计算实现所需细胞播种密度所需的新鲜培养基量，并相应地稀释细胞悬浮液。

细胞观察

在新培养容器中播种细胞后，以以下方式观察具有光学显微镜或其他观察装置的血管中的细胞：

检查是否有可行的单元格

检查以确保细胞均匀分布在容器中

检查除细胞以外的异物是否存在

检查细胞形态

确认上述内容后，将细胞培养容器放在37°C的加湿二氧化碳孵化器中，然后开始培养。

从细胞培养开始到通道

细胞观察

将细胞播种在新的培养容器中，该血管置于二氧化碳培养箱中。 通常，在第二天*，使用光学显微镜或其他观察装置进行以下观测值：

检查以确保培养容器中的细胞以外没有其他异物

确定培养物是否正常通过检查细胞形态和状况*，在某些情况下，根据培养条件和细胞类型，在某些情况下它们可以持续两天。

中型交换

在培养容器中解冻并播种后，细胞开始在二氧化碳孵化器中生长。 细胞将培养基中的营养代谢，因此必须用新鲜培养基代替已耗尽营养并富含代谢物的培养基。 此过程称为“中等变化”或“中等替代”。

在介质变化之前，首先观察细胞以验证培养物正在正常进行。 去除旧介质后，迅速添加新培养基以防止细胞干燥。 如果不浸入培养基，有些细胞可能会死亡，因此在某些情况下，少量的旧培养基被剩下而不是完全丢弃。 此外，应将新鲜培养基预热至37°C，以免使细胞暴露于温度突然变化。

更改介质后，检查细胞是否有损坏的迹象。 使用显微镜获取文化图像，以记录其进行得很好的过程，然后将其归还给孵化器，以便小心减少不必要的干扰。

通道

一旦细胞开始增殖，在当前血管饱满之前，将它们分成新的培养容器。 这称为“通道”。 细胞种植以填充培养容器的状态称为“汇合”。 通常，建议当细胞占据的区域达到约70％至80％的血管时，建议将细胞转移。

当它们变成汇合时，细胞彼此接触，并感到它们不再需要生长，这是一种称为“接触抑制”的现象，尤其是在正常细胞的情况下，它们在通过后将不再增殖。 就癌细胞而言，它们将继续迅速增殖，但它们将缺乏营养，因此允许它们汇合不好是不好的。 因此，有必要观察和监测细胞生长。

悬浮细胞和粘附细胞之间的通道方法不同。

悬浮电池的通过

将细胞培养物悬浮液收集到管中，然后离心以收集细胞。 卸下上清液，留下细胞颗粒，然后在新鲜的培养基中重新悬浮。 采用新鲜悬浮液的一部分，涂上重要的染色锥形蓝色，并计算活细胞的数量。 计算细胞浓度，考虑细胞稀释方法，适当地调节悬浮液中的细胞密度，然后放置在新容器中。

粘附细胞的通过

粘附在培养容器表面的细胞需要以某种方式与其表面分离。 通常，使用胶原酶，分配和胰蛋白酶等蛋白酶。 在胰蛋白酶的情况下，钙或镁离子会抑制活性，因此有必要在施用这些离子之前清洗含有这些离子的培养基。 相反，在钙离子存在下，胶原酶和分散酶显示出活性。

一般过程如下：

去除旧培养基上清液

如有必要，用磷酸盐缓冲液或新鲜培养基洗涤

添加细胞分散酶溶液

在酶的活动范围内的预定温度稳定预定时间，以促进酶促反应

检查显微镜下的细胞脱离程度

通过轻度机械障碍（例如窃听等）促进细胞脱离。

如果可以使用酶的停止溶液，请添加它以停止反应。 如果没有，请添加新鲜培养基以稀释酶并减少活性

移液管几次将细胞分离为单细胞悬浮液

收集包括细胞在内的培养基，通过离心沉淀细胞，并去除含有酶和反应停止溶液的上清液。

点击管子松开细胞颗粒

在收集的细胞管中添加新鲜培养基

通过上下移动来重悬机

准备样品作为代表性的细胞悬浮液来计算细胞数/细胞密度

使用带有血细胞计或自动细胞计数器的显微镜计数细胞数

确定正确稀释以获得所需的细胞密度，添加适当量的新鲜培养基，然后重新降低细胞

播种预定量的细胞悬浮液中的新培养容器

执行显微镜观察

转移到加湿的CO2孵化器，设置为37°C的温度

但是，如果使用分散酶，某些细胞可能会削弱。 在这种情况下，用刮刀机械刮擦并剥离细胞，或者用从移液器到收获细胞的流量将细胞剥离。

细胞培养后加工（库存准备）

重要的是要制作具有与原始单元相同特征的股票，该股票可以从供应商购买或从其他地方转移的原始培养物获得。 这是因为细胞是活物质，其特征可能会随着时间的流逝而变化，如果长时间延续，则可能导致它们与原始细胞不同。

可以创建细胞库存如下：

细胞观察

使用光学显微镜或其他观测设备执行以下观察结果。

检查培养容器中的细胞以外的其他异物

确定细胞是否是亚汇合物，并且没有过度增长

通过检查细胞形态和状况来确定培养是否正常进行

细胞脱离

使用前面描述的通道程序收集库存的细胞。

细胞观察

添加新鲜的培养基通过离心重悬于收集的细胞，但使用少量培养基，因为细胞悬浮液的密度需要高于通过的介质。 细胞通过移液悬浮，并使用显微镜或测量仪器测量细胞/细胞密度的数量。

分配

将细胞悬浮液调节到所需的细胞数量，添加相同数量的2倍浓缩的冷冻保存溶液，然后通过移液重新悬浮。 在不断移动或不断搅拌的同时，将预定量的溶液分配到冷冻管中。

冻结

冷冻管应立即放置在冰箱容器中，并放入深冰箱（-80°C）中，以保持每分钟-1°C的冰点。 或者，使用可编程的控制率冰柜冻结。 细胞冷冻后，冷冻的冷冻管应在液氮储罐或低温深冰箱（-150°C）中存储在蒸气相。 但是，过程取决于冷冻保存解决方案的类型。

确认

解冻一两个冷冻的小瓶和培养它们。 确认细胞是否可以以相同的方式生长并表现出与以前几乎相同的特征。 确认这一点后，停止细胞培养。

开始实验

根据需要解冻准备的细胞库存。 经过一定的培养时间，应将细胞丢弃并解冻新鲜库存。