如何培养实验室的悬浮细胞？

众所周知，实验室培养的细胞种类可以大致分为贴壁细胞和悬浮细胞两种，只有极少数类型细胞同时存在两种状态。

悬浮细胞是指不需要依赖支持物，可在培养基中以悬浮状态生长的一类细胞，如淋巴细胞和大部分血液系统来源细胞。（如小鼠白血病细胞WEHI-3, 人白血病细胞K-562, HL-60）。工业上也有越来越多的贴壁传代细胞被驯化出来，进行全悬浮的培养。目前在工业中应用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293细胞等，它们主要用于重组蛋白质生产；在兽用生物制品中常用的传代细胞主要有采用全悬浮培养的BHK21细胞、MDCK细胞；及借助微载体悬浮培养的Vero细胞、PK细胞、ST细胞、 Marc145细胞等，每种细胞的特性都不同。

悬浮细胞“thp-1”200x

一般情况下，悬浮细胞相较于贴壁细胞的处理更加简单一些，因为悬浮细胞传代时无须胰酶消化。但这并不意味着悬浮细胞比贴壁细胞好养，对新手来说，反而更具挑战性。总是会遇到各种各样的问题：比如，为什么总是出现死细胞和细胞分化；说好了传代很easy的，结果会出现分化；养好了冻存复苏后又出现问题了！

接下来，我们一起探讨一下关于培养悬浮细胞的几个要点吧~

要点一：足够的耐心，这是非常必要的  

很多悬浮细胞在刚从冻存状态复苏时活力是相对较差的，此时我们需要有足够的耐心，等待细胞完成自我修复进入对数增长期。比如THP-1（人单核细胞白血病）从解冻到恢复正常增殖往往需要7-10天的恢复期；Jurkat，Clone E6-1(人T淋巴细胞白血病细胞)复苏后也需要5-7天才能恢复到冻存前的状态。新手可能会在此期间放弃培养，所以，请多一点耐心哦！培养这类细胞也是培养耐心的过程呢！

要点二：接种密度的把握

一般来说，悬浮细胞接种时密度不应低于50万个/ML，很多悬浮细胞有密度依赖，密度低导致的不增殖也是新手常见问题之一。当然，有极少数细胞在密度高时反而状态变差，如W6/32（小鼠B细胞杂交瘤细胞）。因此，培养不了解的细胞前查找相关资料去掌握细胞特性非常重要，知己知彼，方能百战不殆嘛！

换液频率不应该被限制得“明明白白”，细胞是活物，在一个连续培养周期内，视细胞生长状态可分多次添加补充培养基、葡萄糖等特定营养成份，维持细胞良好的生长状态。悬浮培养过程中，随着细胞的增殖，原有培养基中营养物质的消耗，代谢产物的增加，细胞的活率会下降，及时补充营养物质，使细胞处于一个相对良好的生存环境。这里就不再赘述，切忌频繁离心换液。

下面着重聊一聊换液方法：

①离心全换液法‍

即通过离心（800-1000rpm，5min）去除全部旧的培养基，更换新鲜培养基。该方法适合“皮实“好养的悬浮细胞换液(如K562)，或者当前细胞状态良好、密度较高导致培养基消耗较大的情况。此方法的优点是换液彻底，能去除部分细胞碎片，但是同样会对细胞造成一定程度的机械损伤。

②离心半换液法

 即通过离心（800-1000rpm，5min）50%细胞悬液，更换50%体积的新鲜培养基。该方法适合比较“矫情“难养的细胞（如thp-1），或者正在调整状态中、密度较低但碎片较多需要去除的情况。

③沉降换液法

即不使用离心机而是利用重力自然沉降的方法，将培养基与细胞分离，达到全部或部分更换新鲜培养基。但是其有应用局限性—只适合能成一定大小细胞团（否则无法自然沉降，只能低速离心）的细胞，尤其是处理依赖细胞聚集才能增殖的细胞时非常值得推荐，如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。该方法能在换液过程中最大限度避免离心过程造成的机械损伤，同时保留聚集的细胞团，并且去除细胞碎片也较为彻底。

掌握了以上几点，再加上一株好的细胞种子，养出“漂亮“的悬浮细胞就指日可待啦！