细胞培养及其挑战简介

什么是细胞培养？

细胞培养

细胞培养是指在自然环境之外的受控条件下培养细胞的过程。 它是一种 体外 工具，有助于了解细胞生物学和疾病机制。它还在药物发现中发挥作用，例如药物毒性测试和药代动力学/药效学研究，以及个性化医疗。

美国胚胎学家罗斯格兰维尔哈里森在 20 世纪初开发了第一个体外细胞培养技术，当时他成功地从体外的青蛙胚胎中培养出组织碎片。 今天，细胞培养已经帮助了无数的发现，例如针对脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和其他传染病的疫苗的开发。

粘附与悬浮培养

细胞生长有两种基本系统：贴壁培养和悬浮培养。贴壁培养物在人造基质上生长，而悬浮培养的细胞在培养基中自由漂浮。虽然只有少数细胞类型在悬浮液中自然生长（例如淋巴细胞），但许多贴壁细胞类型可以适应悬浮培养。

在悬浮液中培养天然贴壁细胞有两个原因。悬浮培养的第一个优点是细胞更容易传 代，因为您不需要通过酶解或机械解离将它们从培养容器中分离出来。其次，悬浮培养更容易扩大规模，因为细胞生长仅受其在培养基中的浓度限制，而不是受可用表面积限制。悬浮培养的主要缺点是它们需要每日细胞计数和活力测定来遵循生长模式，而贴壁培养可以在显微镜下轻松检查。

2D 与 3D 方法

贴壁培养可进一步分为 2D 和 3D 培养。在 2D 应用中，贴壁细胞在平面上以单层系统生长，例如在细胞培养瓶中。

由于其简单性，2D 技术无法模拟细胞的体内环境，它们通常在具有复杂细胞间相互作用的三维结构中生长。这就是为什么一些实验是使用 3D 培养物进行的，这些培养物可以使用基于支架或无支架的技术进行培养。

基于支架的 3D 方法通常涉及在水凝胶支架中生长贴壁细胞。生物陶瓷、金属或聚合物支架等替代品也用于某些应用。

无支架技术用于通过三种不同方法之一来生长球体：

强制浮动：将细胞悬液装入涂有低粘附性聚合物的微孔板的孔中。然后将微孔板离心以迫使细胞形成球状体。

悬滴：将细胞悬液装入悬滴板的孔中。顾名思义，悬浮液将以液滴形式悬挂在盘子上。细胞将聚集在这些液滴的尖端并形成球体。

基于搅拌：将细胞悬浮液置于旋转的生物反应器中。由于不断的搅拌，细胞不能粘附在壁上，因此形成了球状体。

细胞培养挑战

尽管方法和技术不同，但所有实验都有一个共同点：很难以所需数量培养活细胞以获得可重复的结果。因此，以下部分将专门讨论四大挑战——可重复性、污染、可行性和向自动化的过渡。

再现性

根据 永岳医疗 的一项调查，超过 70% 的科学家报告说他们未能重现另一位科学家的实验，超过一半的人未能重现他们自己的工作。在细胞培养分析中，大部分重现性问题来自细胞传代或代际之间的生物学差异。另一个大问题是细胞系的错误识别，而培养参数的不一致也起着重要作用。

生物变异

每次细胞分裂时，随机突变或转录错误等因素都有可能影响实验的可重复性。为避免这种情况，您应该在新项目开始时创建一个细胞库。

细胞银行

细胞库是指存储多批特定细胞类型以供以后使用的过程，以避免影响可重复性的随机突变或转录错误等因素。第一步是建立一个主细胞库 (MBC)，方法是在培养物中培养选择的感兴趣的细胞类型，并将其冷冻保存在多个容器中。MBC 批次解冻并用于稍后制备工作细胞库 (WBC)。

细胞系的错误识别

自 1960 年代以来，细胞系错误识别问题就为人所知，当时一位科学家描述了 19 种其他人类细胞系的 HeLa 细胞污染。为确保您的结果可靠，更重要的是，确保您不会得出错误的结论，您应该将所有进入实验室的新细胞系进行隔离，直到其来源得到验证。最重要的是，建议在冷冻保存和分发给其他实验室之前以及项目完成后重复细胞系认证。要验证细胞系，您应该首先检查它是否在错误识别细胞系登记册中列出. 如果没有注册，您仍然需要确认其真实性。对于人类细胞系，建议进行短串联重复 (STR) 分析（DNA 指纹）。多种测试方法可用于非人类细胞系，包括核型分析、同工酶分析和线粒体 DNA 分型（DNA 条形码）。

培养参数

第三个影响重现性的因素是培养参数。

例如，氧气水平会显着影响培养的细胞。然而，影响氧合的变量，例如培养室规格或细胞密度，并不总是记录在案，因此无法保持一致。

另一个重要的培养参数是培养基。这提供了必要的营养物质、生长因子和激素，并调节了 pH 值和渗透压。因此，最重要的是其组成始终相同。这对于补充了胎牛血清 (FBS) 的培养基配方尤为苛刻，其成分取决于奶牛的饮食、地理位置和一年中的时间等因素。为了尽量减少 FBS 对结果重现性的影响，您应该在当前库存开始不足时订购不同批次的血清，并对其进行测试以找到最接近的匹配。为了让其他人重现您的结果，您应该报告您如何筛选血清，并记录批号。

细胞处理

大多数研究人员都知道培养参数对其应用有巨大影响，但处理技术的变化往往被忽视。

污染

当细胞从组织中分离出来并在实验室培养时，它们不再受到免疫系统的保护，因此极易受到污染。

第一个污染源是非生物污染物，例如培养基、血清、补充剂或水中的杂质，以及内毒素和可浸出物。预防措施包括使用实验室级水进行细胞培养实验，以及提供内毒素检测认证的制造商提供的培养基、血清、补充剂和消耗品。此外，耗材必须由纯聚苯乙烯或聚丙烯制成，以确保塑料添加剂不会渗入您的细胞培养物中。

第二个污染源是生物污染物，例如细菌（包括支原体）、真菌和酵母菌。

可行性

细胞活力定义为样品中活细胞的比例。除了我们刚刚看到的污染物之外，还有其他各种影响细胞活力的因素。环境条件——温度、pH、渗透压、养分供应以及O 2和CO 2浓度——非常重要。这些变量中的大多数由培养基控制，并且是特定于细胞类型的，不幸的是，这意味着我们无法提供具体的指导方针。

由于细胞对压力非常敏感，因此您不仅要注意环境条件，还要注意您的液体处理技术。

影响细胞活力的最后一个因素是衰老。大多数有限细胞系在死亡前可以存活 20 到 60 次分裂，这意味着它们只能在 15 到 45 代之间重复使用。之后，需要从细胞库中解冻冷冻保存的样本。连续细胞系可以无限增殖，但由于它们容易发生遗传漂变，因此应定期更换。

使用比色法、荧光法和生物发光法的检测分析可用于测量细胞活力。一种常用的比色法是 MTT 法，它基于活细胞将黄色四唑盐还原为紫色甲臜晶体。

自动化

上述许多挑战可以通过自动化细胞培养工作流程来解决。例如，细胞处理将始终保持一致，对重现性和活力产生积极影响。最重要的是，自动化降低了用户污染的风险。

尽管有这些优势，但由于预算原因、机器人没有空间，或者因为没有足够的资源来一次自动化和验证每个步骤，自动化整个工作流程可能具有挑战性。但这可以解决！

我们希望我们能够回答您关于细胞培养的所有问题，并且您现在对使用快乐细胞进行可重复的实验更有信心。